살아있는 세포의 지질 분해능: 초분광 중적외선 광음향 현미경의 새로운 혁신

지질은 세포막의 구조적 구성요소이자 에너지 저장 분자일 뿐만 아니라 암, 비만, 당뇨병, 심혈관 질환, 신경퇴행성 질환의 발생 및 발병과도 밀접한 관련이 있습니다. 그러나 살아있는 세포에서 다양한 유형의 지질을 직접 관찰하고 구별하는 것은 오랫동안 기술적 어려움에 직면해 왔습니다. 전통적인 형광 라벨링 방법은 라벨링 효율성, 특이성 및 세포 기능에 대한 잠재적 간섭으로 인해 제한되는 반면, 라벨 없는 광학 기술은 유사한 화학 구조를 가진 지질 분자를 구별하는 데 종종 어려움을 겪습니다.

Nature Methods는 "Hyperspectral Fingerprint-region Photoacoustic Microscopy"(hyFOPM)라는 기술을 소개하는 연구를 발표했습니다. 이 기술은 중적외선 지문 영역의 단일 결합 진동 모드를 활용하여 살아있는 세포에서 스핑고미엘린(SM)과 콜레스테롤(Chol)의 라벨 없는 검출 및 동적 이미징을 가능하게 합니다.

기술원리
대부분의 라벨 없는 광학 방법은 CH 신축 진동 영역(약 2800~3000 cm⁻²)의 신호에 의존하지만 이 영역의 스펙트럼 밴드는 다양한 지질에서 매우 유사하므로 서로 다른 유형을 구별하기가 어렵습니다. 반면 중적외선 지문 영역(900~1730cm⁻²)에는 아미드 결합, 에스테르 결합, 스테로이드 고리의 특징적인 흡수 등 분자의 고유한 구조를 반영하는 단일 결합 진동 정보가 더 많이 포함되어 있습니다.

hyFOPM 시스템의 설계는 이 개념에 중점을 두고 있습니다. 여기 소스로 조정 가능한 양자 캐스케이드 레이저를 사용하여 900~2932 cm⁻² 범위를 2 cm⁻²의 스펙트럼 분해능으로 포괄합니다. 레이저 펄스는 샘플을 자극하여 광음향 신호를 생성하며, 이 신호는 초음파 변환기에 의해 감지되어 초분광 이미지를 구성합니다. 이 시스템은 약 4.3μm의 공간 분해능을 갖추고 있어 살아있는 세포 수준의 이미징이 가능합니다.

지질 모델 검증
연구팀은 기술의 타당성을 검증하기 위해 먼저 콜레스테롤(Chol), 불포화 포스파티딜콜린(DOPC), 스핑고미엘린(SM)이 포함된 2차원 지질 용액 모델을 준비했다.

(1) 스펙트럼 특성 비교

hyFOPM에 의해 수집된 지문 영역 스펙트럼은 ATR-FTIR 결과와 매우 일치합니다. 세 가지 지질은 구별 가능한 스펙트럼 피크를 나타냅니다. 콜레스테롤은 1056cm⁻1에서 스테로이드 고리 변형에 대해 강한 흡수 피크를 나타냅니다. DOPC는 1731 cm⁻²에서 에스테르 그룹의 C=O 신축 진동을 특징으로 합니다. 스핑고미엘린은 각각 1645 cm⁻1, 1555 cm⁻1 및 1464 cm⁻1에서 아미드 I 밴드, 아미드 II 밴드 및 지방산 CH2 굽힘 진동에 해당합니다.

(2) 스펙트럼 비혼합 및 분류 능력
선형 비혼합을 위해 지문 영역에서 15개의 파수만 사용하는 경우 콜레스테롤과 스핑고미엘린 사이의 혼선은 0%에 가까운 반면 DOPC의 혼선은 23%입니다. 대조적으로, CH 신축 영역에서 7개의 파수를 사용하면 누화가 크게 증가합니다. 선형 판별 분석(LDA)을 추가로 적용하면 지문 영역 또는 CH 영역을 사용할 때 평균 분류 정확도가 96%에 도달하고 모든 파수를 사용할 때 97%에 도달하는 것으로 나타났습니다.

(3) 거대 단층 소포(GUV) 모델
이 연구는 세포막을 시뮬레이션하기 위해 세 가지 유형의 GUV를 준비했습니다. 모델 1, SM과 Chol의 1:1 혼합물로 조밀하게 정렬된 막을 형성합니다. 액체 정렬 및 액체 무질서 단계에 공존하는 DOPC, SM 및 Chol의 2:2:1 혼합물인 모델 2; 및 순수 DOPC인 모델 3은 무질서한 유체 막을 형성합니다. 2852cm⁻²에서 hyFOPM으로 얻은 이미지는 Nile Red 형광 염색으로 얻은 이미지와 형태학적으로 일치합니다. 다양한 소포의 스펙트럼 특성은 순수한 지질에 해당하며, 이는 혼합된 막의 개별 구성 요소를 식별할 수 있음을 확인합니다.

(4) 품질 관리 응용
연구팀은 각 유형에 대해 10개의 서로 다른 GUV에 대한 스펙트럼 측정을 수행하고 3원 상태도를 플로팅함으로써 실제 지질 구성이 목표 비율에서 벗어남(약 40%의 불일치)을 발견했습니다. 이는 hyFOPM이 GUV 준비의 품질 평가에 사용될 수 있음을 나타냅니다.

살아있는 세포에서의 응용
이 연구는 hyFOPM을 살아있는 세포에 추가로 적용하여 각각 두 가지 세포 모델에서 스핑고미엘린과 콜레스테롤의 동적 변화를 관찰했습니다.

(1) A549 세포의 스핑고미엘린 축적
인간 폐 선암종 세포(A549)를 스핑고미엘린의 축적을 유도할 것으로 예상되는 항종양 화합물 2-하이드록시올레산(2-OHOA)으로 처리했습니다. 50개의 세포에서 지문 영역 스펙트럼(1600~1400 cm⁻²)을 수집한 결과, 같은 기간 동안 대조군에서는 23%만 증가한 데 비해 처리 후 1464 cm⁻² 피크 면적이 117% 증가한 것으로 나타났습니다. 그 후, 4개의 파수(총 지질의 경우 2852 cm⁻², 단백질 아미드 II의 경우 1540 cm⁻², 스핑고미엘린의 경우 1464 cm⁻², 콜레스테롤의 경우 1048 cm⁻²)만을 사용하여 3000개의 세포에 대해 이미징을 수행했습니다. 그 결과, 스핑고미엘린 신호는 치료 후 48시간과 72시간에 계속 상승하는 반면, 콜레스테롤 신호는 큰 변화를 보이지 않는 것으로 나타났습니다.

(2) HEK 세포의 콜레스테롤 로딩
인간 배아 신장 세포(HEK293)를 메틸-β-사이클로덱스트린-콜레스테롤 복합체(MβCD-Chol)와 함께 배양하여 세포막의 콜레스테롤을 증가시켰습니다. 50개 세포의 지문 영역 스펙트럼에서는 치료 후 1048 cm⁻² 피크 면적이 161% 증가한 반면 스핑고미엘린의 1464 cm⁻² 피크 면적은 약간 감소한 것으로 나타났습니다. 이는 사이클로덱스트린이 콜레스테롤을 전달하는 동안 일부 막 지질을 추출한다는 알려진 특성과 일치합니다. 3000개 세포에 대한 다중 파수 이미징을 통해 콜레스테롤 신호의 상승이 추가로 확인되었으며, 총 지질 신호는 약간 증가하고 단백질 신호는 거의 변화하지 않았습니다.

의의와 전망
이 연구는 라벨링 없이 살아있는 세포에서 유사한 화학 구조를 가진 지질 분자를 구별하는 능력을 보여줍니다. 형광 또는 동위원소 라벨링에 의존하는 전통적인 방법에 비해 hyFOPM은 라벨링 효율성 및 세포 기능 간섭과 같은 문제를 피하고 여기 파수를 조정하여 표적 지질의 스펙트럼 특징에 선택성을 유연하게 적용할 수 있습니다.

지문 영역에서 현재 시스템의 스펙트럼 특이성은 CH 스트레칭 영역의 스펙트럼 특이성보다 우수하며, 이는 더 많은 지질 하위 유형을 구별할 수 있는 가능성을 열어줍니다. 또한, 연구에서는 딥러닝과 같은 첨단 스펙트럼 분리 기술을 결합하면 민감도와 특이도가 더욱 향상될 것으로 기대한다고 지적합니다. 또한 중적외선 광음향 현미경은 조직에서 150μm 이상의 이미징 깊이에 도달할 수 있으며 향후 응용 분야는 두꺼운 샘플이나 생체 내 설정으로 확장될 수 있습니다. 기술 가속화(예: 스펙트럼 언더샘플링) 및 시스템 소형화는 현장 분석 또는 일상적인 실험실 테스트를 향해 이 기술을 발전시키는 중요한 방향입니다.